XVII. PATOLOGÍA MOLECULAR

(1) AISLAMIENTO DE MATERIAL GENÉTICO: suspensiones cleulares frescas o criopreservadas, tejido fresco, congelado o en parafina, microdisección.

(2) SONDAS: tipo y forma de marcaje.

(3) TÉCNICAS EMPLEADAS: amplificación de ácidos nucléicos (reacción en cadena de polimerasa o 'PCR'), dot-blot, Southern-blot, hibridación in situ, hibridación in situ fluorescente, secuenciación, análisis de micromatrices.

(4) Generalidades de la técnica de reacción en cadena de polimerasa ('PCR').

(5) Generalidades de la técnica de Southern-blot (enzimas de restricción, desnaturalización del ADN, electroforesis, aplicaciónde sondas, etc.).

(6) Generalidades de la técnica de hibridación in situ e hibridación in situ fluorescente ('FISH') (en células metafásicas -cromosomas-, e interfásicas).

(7) Algunos ejemplos de aplicación diagnóstica en enfermedades infecciosas

(8) Algunos ejemplos de aplicación diagnóstica en neoplasias:

(8.a) Predisposición genética (poliposis adenomatosa del colon, síndromes de neoplasias endocrinas múltiples, retinoblastoma familiar, síndrome de Von Hippel-Lindau, síndrome de cáncer colorrectal no asociado a poliposis -Lynch-, síndrome de cáncer hereditario de mama-ovario, síndrome de Li-Fraumeni).

(8.b) Detección precoz de cáncer (carcinoma de cérvix, esófago de Barrett)

(8.c) Diagnóstico de tipos específicos de neoplasias:

(8.c.1) Translocaciones específicas en neoplasias linfohematopoyéticas (linfomas folicular, del manto, de Burkitt, de la zona marginal, anaplásico de células grandes, etc.)

(8.c.2) Translocaciones específicas en sarcomas (sarcoma de Ewing/tumor neuroectodérmico primitivo, tumor desmoplásico de células redondas y pequeñas, liposarcoma mixoide, condrosarcoma mixoide, sarcoma sinovial, rabdomiosarcoma alveolar, dermatofibrosarcoma protuberans).

(8.d) Análisis de expresión génica (micromatrices).

(8.e) Análisis de clonalidad en neoplasias linfoides.

(8.f) Determinación pronóstica.

*Para este tema deben leer y elaborar un resumen del siguiente artículo: Wistuba OI. 'Patología molecular: aplicaciones de la biología molecular en anatomía patológica'. Rev Méd Chile 2001;129(7):1-16. También les recomiendo leer la parte final del capítulo 'enfermedades genéticas' de la versión más reciente que puedan encontrar de Patología Estructural y Funcional de Robbins especialmente para la técnica de Southern-blot y el recuadro de 'análisis de expresión génica (micromatrices)' que aparece en la parte final del capítulo de 'neoplasia'.

XVI. CITOMETRÍA

I. CITOMETRÍA DE FLUJO.

A. Preparación de la muestra: tipo de material que puede analizarse, empleo de los fluorocromos.
B. Generalidades de la técnica.
C. ¿Qué información útil brinda al médico? (aplicaciones comunes: identificación de subgrupos de células linfohematopoyéticas, cuantificación de ADN -ploidía e índice de proliferación-).
D. Histogramas (mediciones uniparamétricas y multiparamétricas).
E. Definición de los términos: diploide, aneuploide, fracción hiperdiploide, fase S, índice de ADN, índice de proliferación.

II. CITOMETRÍA/HISTOMETRÍA DE IMAGEN (ESTÁTICA).

A. Preparación de la muestra: tipo de material que puede analizarse, empleo de la tinción de Feulgen.
B. Generalidades de la técnica.
C. ¿Qué información útil brinda al médico? (aplicaciones comunes: cuantificación de ADN -ploidía e índice de proliferación- y morfometría -tamaño, número, distancia-).
D. Diferencias con la citometría de flujo, ventajas y desventajas.

XV. INMUNOHISTOQUÍMICA.

(1) Ventajas de esta técnica sobre la inmunofluorescencia.

(2) Generalidades de la técnica: enzimas empleadas (peroxidasa, fosfatasa alcalina, etc.), cromógenos o 'reveladores' (diaminobencidina, aminoetilcarbazol, etc.).

(3) Generalidades de los diversos métodos de IHQ: directo e indirecto, métodos de recuperación antigénica (enzimas proteolítcas, calor, etc.), métodos de amplificación (peroxidasa/antiperoxidasa, avidina/biotina, método con polímero y con tiramida y otros). Para este punto particular, les recomiendo leer el siguiente artículo: Dodson A. Modern methods for diagnostic immunocytochemistry. Current Diagnostic Pathology 2002;8:113-122 (la revista impresa está en la biblioteca de nuestro Servicio).

(4) Ejemplos de antígenos que pueden demostrarse: hormonas, receptores, proteínas extracelulares, intracelulares (enzimas, filamentos intermedios, antígenos específicos de tumor), antígenos leucocitarios, antígenos de proliferación, microorganismos, productos de oncogenes. Para este punto particular, deberán hacer un resumen PERSONAL del artículo completo: Jorge DL, Lara CO, Ortiz HC.  'Interpretación básica de inmunohistoquímica. Características generales de diversos anticuerpos y su localización celular y subcelular' Patología 2007;43(3):126-140 (el artículo en formato PDF lo subí al Google Drive, carpeta R-1). 

(5) Ejemplos de aplicaciones potenciales de la IHQ:
- Clasificación, pronóstico y respuesta a tratamiento de neoplasias,
- Distinción de proliferaciones neoplásicas vs. no neoplásicas (ejemplos: linfocitos B, próstata),
- Diagnóstico de enfermedades infecciosas, etc.

(6) En la carpeta R-1 del Google Drive encontrarán un escrito  sobre usos generales de la IHQ en patología diagnóstica. Se repartirán  equitativamente el trabajo y prepararán una presentación MUY BREVE, sobre este escrito (Applications of immunohistology to non-heme tumor differential diagnosis. RV Rouse http://surgpathcriteria.stanford.eduRouse) .

USOS DE LA IHQ EN PATOLOGÍA DIAGNÓSTICA:

(1)Diagnóstico diferencial de neoplasias:

1.a EPITELIALES (queratinas de bajo y alto peso molecular, queratinas 7 y 20, TTF-1, Napsina A, Arginasa A, CDX-2,  GCDPF15, antígeno carcinoembrionario, antígeno epitelial de membrana, CA-125, lisozima),
1.b HEMATOLINFOIDES (CD-45, CD-3, CD-20, CD-79a, CD-22, PAX-5, CD-4, CD-8, CD-23, ciclina D1, BCL-2, BCL-6, CD-5, SOX-11, MUM-1, CD-138, CD-15, CD-30, CD-68, ALK, CD-56, granzima, TdT, CD-34, mieloperoxidasa, cd-33, elastasa, triptasa, CD-10, languerina/CD-207, CD-1a, CD-21, CD-35),
1.c NEURALES –neuroblastoma, paraganglioma, feocromocitoma- (neurofilamentos,  enolasa neurono específica),
1.d GLIALES (proteína ácida gliofibrilar),
1.e NEUROGÉNICOS –schwannianos- (proteína S-100, CD-57-Leu-7, proteína básica de mielina, SOX-10),
1.f NEUROENDOCRINOS (cromogranina, sinaptofisina, CD-57, deshidrogenasa succínica B), MELANOCÍTICOS (proteína S-100, HMB-45, Mart-1, SOX-10),
1.g MUSCULARES (diferentes tipos de actinas –de mùsculo liso, sarcomérica, etc.-, desmina, miogenina, Myo-D1, mioglobina, miosina, calponina, caldesmona),
1.h GERMINALES (SALL-4, OCT3/4, fosfatasa alcalina placentaria, gonadotrofina coriónica, alfa-feto-protéina, lactógeno placentario),
1.i  TUMORES NEUROECTODÉRMICOS PRIMITIVOS/EWING (CD-99/MIC-2, FLI-1),
1.j VASCULARES  (CD-31, CD-34, ERG, antígeno relacionado a factor VIII, lectina de ulex europaeus),
1.k PROSTÁTICOS (antígeno prostático específico, fosfatasa alcalina prostática),
1.l TIROIDEOS (tiroglobulina, calcitonina, TTF-1),
1.m CÉLULAS DE CORDONES SEXUALES/ESTROMA OVÁRICO (inhibina),
l.n TUMORES DEL ESTROMA GASTROINTESTINAL (CD-117/c-kit, DOG-1, deshidrogenasa succínica)
1.o ADENOCARCINOMA VS. MESOTELIOMA (queratinas, CD-15/Leu-M1, antígeno carcinoembrionario, antígeno epitelial de membrana, BerEP4, B72.3, calrretinina, WT1, trombomodulina, mesotelina).

(2) Marcadores pronósticos en neoplasias:

2.a PROLIFERACIÓN (Ki-67, antígeno nuclear de proliferación),

2.b ONCOPROTEÍNAS (c-erb-B2 ó Her-2/neu, Rb, p53, bcl-2, inhibidores de cinasas dependientes de ciclinas p21 y p16).

(3) Diferenciación entre proliferación neoplásica/no neoplásica:

3.a PRÓSTATA (marcadores de células basales –queratina de alto peso molecular 34-beta-E12 y p63-, alfa-metilacil-CoA-racemasa),

3.b MAMA (marcadores de células mioepiteliales –actina y p63-),
3.c PROLIFERACIONES DE CÉLULAS B (cadenas ligeras de Ig).

(4) Respuesta a tratamiento de neoplasias:

4.a MAMA (receptores de estrógenos y progesterona),

4.b TUMORES ESTROMALES GASTROINTESTINALES (CD-117/c-kit),

4.c PRÓSTATA (receptores de andrógenos).

(5) Enfermedades infecciosas: VIRUS, BACTERIAS, HONGOS, PROTOZOARIOS.

XIV. INMUNOFLUORESCENCIA

(1) ¿Qué es fluorescencia?

(2) Generalidades de la técnica: fluorocromos, espectro de absorción y emisión, ejemplos de fluorocromos más empleados, microscopio de epifluorescencia, anticuerpos marcados, técnica directa e indirecta (empleo de cada una en la práctica médica).

(3) Manejo de la muestra (biopsia). cortes por congelación, medio de transporte.

(4) Elaborar un cuadro sinóptico de los resultados de esta técnica en padecimientos renales (patrón y tipo de depósito) en:

-Enfermedad de cambios mínimos,

-Glomeruloesclerosis focal y segmentaria,

-Glomerulonefritis posinfecciosa,

-Glomerulopatía membranosa,

-Glomerulonefritis membranoproliferativas 1 y 2,

-Glomerulopatía por Ig A, púrpura de Henoch-Schönlein

-Glomerulonefritis proliferativas extracapilares (vasculitis por ANCA, síndrome de Goodpasture, L.E.S., posinfecciosas, etc.)

(5) Elaborar uncuadro sinóptico de los resultados de esta técnica en padecimientos cutáneos (enfermedades ampollosas -pénfigo, penfigoide, dermatitis herpetiforme-, lupus eritematoso discoide y sistémico) y vasculitis por depósito de complejos inmunes (lupus eritematoso, crioglobulinemia, púrpura de Henoch-Schönlein, etc.).

(6) MICROSCOPIO LÁSER CONFOCAL: generalidades del sistema, usos, ventajas (resolución, contraste, análisis de imágenes, posibilidad de hacer secciones ópticas, reconstrucción tridimensional).