XI. MICROSCOPIA ELECTRÓNICA (ENFERMEDADES METABÓLICAS Y MIOPATÍAS)

(1) Conceptos generales de enfermedades por defectos enzimáticos (intra y extralisosómicas).

(2) Usos y limitantes de la microscopía electrónica de transmisión en el diagnóstico de enfermedades por defectos enzimáticos.

(3) Características ULTRAESTRUCTURALES de las siguientes enfermedades:

- Glucogenosis: hepática (p. ej. tipo I -Von Gierke-), muscular (p.ej. tipo V -McCardle-), sistémica (p.ej. tipo II -Pompe-).

- Mucopolisacaridosis.

- Sialidosis.

- Enfermedad de Gaucher (deficiencia de glucocerebrosidasa).

- Enfermedad de Niemann-Pick (deficiencia de esfingomielinasa).

- Enfermedad de Tay-Sach (gangliosidosis GM 2).

- Enfermedad de Fabry (deficiencia de alfa-galactosidasa).

- Leucodistrofia metacromática (deficiencia de aril-sulfatasa-A).

- Lipofuscinosis ceroide neuronal.

- Deficiencia de alfa-1-antitripsina.

- Proteinosis alveolar.

- Miopatías: centronuclear, por cuerpos de inclusión, nemalínica, mitocondrial, miositis por cuerpos de inclusión, degeneración de fibras

X. MICROSCOPIA ELECTRÓNICA (AGENTES INFECCIOSOS)

Objetivos generales:

(1) Recordar la estructura general de las principales clases de microorganismos (virus, bacterias, hongos y protozoarios).

(2) Identificar la ultraestructura esencial de algunos agentes infecciosos de importancia en patología diagnóstica.

I. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE MICROORGANISMOS:

(a) Virus: genoma, capsómeros, cápside, nucleocápside, virión, envoltura (cubierta). Clasificación de los virus de acuerdo al tipo de ácido nucléico, simetría de la cápside y presencia de cubierta. Estructura general de familias de importancia patógena para el humano (parvovirus, papovavirus, adenovirus, herpesvirus, poxvirus, picornavirus, reovirus, togavirus, retrovirus, orthomyxovirus, paramyxovirus, rhabdovirus).

(b) Bacterias: diferencias entre célula procarionte y eucarionte. Generalidades de estructura bacteriana: genoma, membrana, pared. Clasificación general de los principales grupos bacterianos: espiroquetas, miceliales (actinomicetos), intracelulares obligadas (rickettsias, chlamydias), cocos y bacilos grampositivos y negativos, carentes de pared (mycoplasmas).

(c) Hongos: cápsula, membrana, núcleo, organelos.

(d) Protozoarios: membrana, núcleo, organelos, cinetoplasto, flagelos, etc.

II. ULTRAESTRUCTURA DIAGNÓSTICA DE MICROORGANISMOS ESPECÍFICOS:

(1) BACTERIAS.

(a) Enfermedad de Whipple.

(2) VIRUS.

(a) Virus herpes.

(b) Papovavirus y papilomavirus.

(c) Virus de la rabia.

(d) Parvovirus B19.

(e) H.T.L.V. y V.I.H.

(3) PROTOZOARIOS.

(a) Toxoplasma gondii.

(b) Cryptosporidium sp.

(c) Isosopora sp.

(d) Trypanosoma cruzi.

(4) HONGOS.

(a) Pneumocystis jiroveci.

(b) Histoplasma capsulatum.

(c) Criptococcus neoformans.

Al finalizar el tema deben hacer un resumen del artículo:

Goldsmith G, Miller S.
Modern Uses of Electron Microscopy for Detection of Viruses.
CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, 22(4):552–563

El artículo está en Google Drive depatologíahgm@gmail.com carpeta R-1

IX. MICROSCOPIA ELECTRÓNICA (ULTRAESTRUCTURA NORMAL)

I. GENERALIDADES DE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

1. ESTRUCTURA DEL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN.
a. Límite de resolución del microscopio electrónico de transmisión.
b. Componentes esenciales del microscopio electrónico de transmisión: cañón de electrones, lentes condensadora y proyectoras, pantalla fluorescente.
c. Formación de imágenes en el microscopio electrónico de transmisión (electrones dispersados, no dispersados y secundarios).


2. TÉCNICA HISTOLÓGICA EN MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN
a. Fijación (glutaraldehído) y posfijación (teróxido de osmio).
b. Deshidratación y agentes aclarantes (óxido de propileno).
c. Inclusión (resinas epóxicas, acrílicas y poliestéricas).
d.Corte (ultramicrotomo).
e. Montaje (rejillas).
f. Contraste (metales pesados)

3. GENERALIDADES DE LAS APLICACIONES DEL M.E.T. EN PATOLOGÍA DIAGNÓSTICA.

II. ULTRAESTRUCTURA NORMAL DE LA CÉLULA ANIMAL.

a) Membrana celular

b) Núcleo (genoma, ADN y ARN's, histonas, mecanismos génicos básicos -duplicación de ADN, transcripción, traducción y síntesis protéica).

c) Aparato biosintético: ribosomas, retículo endoplásmico (rugoso y liso), aparato de Golgi

d) Gránulos de secreción, lisosomas, fagosomas, endosomas, fagolisosomas, proteasomas.

e) Mitocondrias

f) Citoesqueleto (filamentos delgados, intermedios y gruesos, microtúbulos, centríolos)

g) Microvellosidades y cilios.

h) Uniones intercelulares (desmosomas, nexos, ocluyentes).

i) Activación y señalización celular (factores de crecimiento y sus receptores, vías de transducción de señales)
j) Matriz extracelular e interacciones de las células con ésta.
k) Ciclo celular y proliferación.

*Al finalizar este tema deben entregar un resumen COMPLETO de todo el capítulo I (The cell as a unit of health and disease. Kumar, Abbas, Aster. Robbins and Cotran pathologic basis of disease, 9th. Ed. 2015)

*Les recomiendo visitar la página 'Life Science' de la Universidad de Tokio.  Es una excelente referencia sobre aspectos básicos de biología celular: concisa, muy didáctica,  permite copiar imágenes y es posible incluso guardar todos los capítulos en formato PDF.

La dirección es:  http://csls-text.c.u-tokyo.ac.jp/index.html

VIII. HISTOQUÍMICA.

1. Generalidades de histoquímica (tinciones) aplicada a microscopia.



2. Colorantes ácidos y básicos.



3. Hematoxilina y eosina.



4. Tinciones para tejido conectivo: fibrina, colágena, fibras elásticas, fibras reticulares.

5. Tinciones para glucógeno y mucinas (proteoglicanos, sulfomucina, sialomucina, ácido hialurónico).

6. Tinciones para lípidos.

7. Tinciones para ácidos nucléicos (ADN, ARN).



8. Tinciones para pigmentos (hemosiderina, melanina, lipofuscina, substancias cromafines) y minerales (calcio, cobre).

9. Tinciones para amiloide.

10. Tinciones para microorganismos: micobacterias, bacterias, actinomicetos, hongos, protozoarios, parásitos.

11. Tinciones para organelos y gránulos citoplásmicos (células cebadas, cuerpos hialino-alcohólicos, regiones organizadoras de nucléolos -'NORs'-, gránulos neuroendocrinos -argirófilos y argentafines-).

12. Tinciones en neuropatología (neuronas, células gliales, axones, mielina).

13. Tinciones hematológicas (de Romanovsky).

VII. TÉCNICA HISTOLÓGICA.

1. Definición de técnica histológica.

2. Pasos secuenciales de la técnica histológica con parafina para microscopio óptico.

3. FIJACIÓN:

3.1 Acciones generales de los fijadores.

3.2 Factores que influyen en la fijación: pH, temperatura, penetración, duración, etc.

3.3 Clasificación de fijadores (aldehídos, agentes oxidantes, coagulantes, etc.)

3.4 Fijadores más comunes: formaldehido, glutaraldehído, tetraóxido de osmio, dicromato de potasio, permanganato de potasio, ácido acético, alcohol metílico y etílico, cloruro de mercurio, ácido pícrico, etc.).

3.5 Mezclas de fijadores: soluciones de formaldehído, solución de Carnoy, Bouin, Zenker.

3.6 Fijación de substancias especiales (lípidos, carbohidratos, etc.).

3.7 Fijación para técnicas especiales (histoquímica enzimática, microscopia electrónica, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, citometría de flujo).

3.8 Fijación especial para tejidos específicos (ojo, riñón, hígado, ganglios linfáticos, etc.)

3.9 Artificios por fijación (*ver referencia al final).

4. DESHIDRATACIÓN (agentes deshidratantes: etanol, metanol, alcohol isopropílico, acetona).

5. ACLARAMIENTO (agentes aclarantes: xileno, tolueno, cloroformo, etc.).

6. IMPREGNACIÓN E INCLUSIÓN (parafina y otros agentes -resinas, agar, gelatina, celoidina, etc.-).

7. CORTE (microtomo).

8. Procesamiento automatizado.

9. Cortes por congelación (criostato).

10. Descalcificación.


*El tema de TINCIÓN, que forma parte de la técnica histológica, lo revisaremos más adelante, cuando hablemos de histoquímica.

* Vayan al Google Drive de patologiahgm@gmail.com/PATOLOGIA HGM/R-1/CURSO DE INTRODUCCIÓN y bajen el artículo que aparece en esa carpeta como "efecto de la fijación en inmunohistoquímica" (en PDF)  de Werner M y cols. 'Effect of Formalin Tissue and Processing on Immunohistochemistry', Am J Surg Pathol 2000; 24(7):1016-1019, léanlo y hagan un resumen.

VI. MICROSCOPÍA ÓPTICA (PARTE 2).

SISTEMA ÓPTICO Y MECÁNICO DEL MICROSCOPIO.


1. Localizar en un objetivo: indicaciones de factor de aumento, apertura numérica, espesor del cubreobjetos, longitud del tubo, agente de inmersión, y corrección de aberraciones.

2. Función del diafragma del condensador.

3. Apertura ideal de la apertura numérica del condensador.

4. Incrementar el contraste y la profundidad de campo del área observada, efectos sobre la apertura numérica y la resolución

5. Identificar en un microscopio: diafragma de campo, condensador, diafragma del condensador, objetivos, oculares, tornillos de centrado del condensador, tornillos de enfoque macro y micrométrico, tornillo y cremallera del condensador, platina, brazo o estativo, tubo.

6. Lentes oculares. Especificaciones de factor de aumento y cifra de campo.

7. Cálculo de aumentos totales de un microscopio.

8. Cálculo de diámetro de campo visual.

9. Cálculo de área de campo visual.

10. Cálculo del diámetro y el área de campo visual para cada uno de los objetivos de su microscopio.

11. Principios básicos de micrometría (uso del micrómetro de ocular).

12. Cálculo de aumentos útiles máximos y mínimos para cada uno de los objetivos de su microscopio.

13. Procedimiento de iluminación de Köhler: importancia y pasos para conseguirla.

Tarea:

- Calcular diámetro y área de campo visual del objetivo 40X de su microscopio.

- Calcular aumentos útiles (mínimos y máximos) para cada uno de los objetivos de su microscopio.
Lecturas recomendadas:

(1) Cetto Ana María. 'La Luz'. Colección 'La ciencia para todos', No. 32. Ed. Fondo de Cultura Económica. México. 1999.

(2) Malacara Daniel. 'Óptica tradicional y moderna'. Colección 'La ciencia para todos', No.84. Ed. Fondo de Cultura Económica. México. 1997.

(3) Abramowitz Mortimer 'Microscope basics and beyond', volumen 1, 2003 (puede bajarse gratuitamente como archivo PDF buscando en: 'Introduction to Optical Microscopy, Digital Imaging, and Photomicrography' http://micro.magnet.fsu.edu/primer/index.html)

(4) Davidson M., Abramowitz M. 'Optical microscopy' (puede bajarse gratuitamente como archivo PDF en la misma página Web señalada en la referencia anterior).

MICROSCOPIO DE POLARIZACIÓN.

(1) Planos de vibración de la luz.

(2) Definición de polarización y luz polarizada.

(3) Definición de dicroismo.


(4) Definición de isótropo (monorrefringente) y anisótropo (birrefiringente).

(5) Componentes básicos del microscopio de polarización (filtros polarizador y analizador).

(6) Usos frecuentes de la luz polarizada en patología diagnóstica.

VI. MICROSCOPÍA ÓPTICA (PARTE 1).

Generalidades y propiedades de la luz.
Lentes y aberraciones.

1. Sistema de medición: decímetro, centímetro, milímetro, micrómetro (micra), nanómetro y Angstrom.

2. El espectro electromagnético, tipos de ondas, luz visible.

3. Longitud y amplitud de onda.

4. Propiedades físicas de la luz: reflexión, refracción, dispersión y difracción.

5. Densidad óptica e índice de refracción.

6. Relación entre longitud de onda de los rayos luminosos y refracción al atravesar un medio transparente.

7. Relación entre longitud de onda de los rayos luminosos y difracción.

8. Ondas en fase y desfasadas, interferencia de ondas.

9. Lentes convergentes y divergentes

10. Formación de imágenes en un lente convergente, modificaciones respecto a la distancia en que se coloca el objeto respecto al lente.

11. Importancia de los rayos directos y difractados en la formación de imágenes.

12. Diferencia entre un microscopio simple y compuesto.

13. Función de lente objetivo y de lente ocular en el microscopio compuesto.

14. Apertura angular o ángulo de aceptación de un lente objetivo.

15. Apertura numérica y forma de calcularla, cómo afecta a la apertura numérica el índice de refracción del medio entre el objeto y la lente.

16. Definición de poder y límite de resolución, relación de éstos con apertura numérica y longitud de onda de la luz empleada.

17. Límite de resolución de un microscopio óptico.

18. Principales tipos de aberraciones de las lentes (cromática, esférica y de planicidad de campo); nomenclatura de objetivos que corrigen esas aberraciones: acromáticos, planacromáticos, plansemiapocromáticos ('fluoritas', 'plan-neofluar'), planapocromáticos.

Para esta sesión, además de leer y hacer un resumen sobre los conceptos de óptica arriba señalados, deberán leer y elaborar un comentario, no mayor a una cuartilla, sobre los cuatro capítulos del tema 'Física' del libro 'X Representa lo Desconocido' (Isaac Asimov, Ed. Plaza & Janés, 1985) en los que se narra la historia del descubrimiento del espectro electromagnético.  Hay una copia del libro en PDF en Google Drive de patologiahgm@gmail.com/PATOLOGIA HGM/R-1/Curso de Introducción a la Patología).

Además, les recomiendo visitar:

 http://micro.magnet.fsu.edu/primer/index.html ('Introduction to optical microscopy, digital imaging and photomicrography') (Excelente sitio donde podrán encontrar todo lo referente a microscopia óptica de campo claro y otras modalidades de microscopia).